到了三級文明，有關克隆，已經研究到了分子水平，也就是分子克隆！

    什是分子克隆呢？

    在分子水平上提供一種純化和擴增特定dna片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉化與轉導的方式，引入適合的寄主體內得到複製與擴增，然後再從篩選的寄主細胞內分離提純所需的克隆載體，可以得到插入dna的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。

    分子克隆是指分離一個已知dna序列，並以in viv(活體內)方式獲得許多複製品的過程。這一複製過程經常被用於增加並獲取dna片段中的基因，但也可用來增加某些任意的dna序列，如啟動子、非編碼序列、化學合成的寡核酸或是隨機的dna片斷。

    將dna片段(或基因)與載體dna分子共價連接，然後引入寄主細胞，再篩選獲得重組的克隆，按克隆的目的可分為dna和dna克隆兩類。

    dna克隆是以rna為原材料，經體外反轉錄合成互補的dna(dna)，再與載體dna分子連接引入寄主細胞。每一dna反映一種a克隆的分布也反映了rna的分布。特點是:

    有些生物，如rna病毒沒有dna，隻能用dna克隆;

    dna克隆易篩選。因為dna庫中不包含非結構基因的克隆，而且每一dna克隆隻含一個rna的信息;

    dna能在細菌中表達。dna僅代表某一發育階段表達出來的遺傳信息，隻有基因文庫才包含一個生物的完整遺傳信息。

    那。如何做到這一點呢？

    首先是dna片段的製備！

    常用以下方法獲得dna片段:1用限製性核酸內切將高分子量dna切成一定大的dna片段;用物理方法(如超聲波)取得dna隨機片段;在已知蛋白質的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對應的基因片段;4從a。

    其次是載體dna的選擇，這要知道，什是質粒。

    質粒是細菌染色體外遺傳因子，dna呈環狀，大為1-00千堿基對(kb)。在細胞中以遊離超螺旋狀存在，很容易製備。質粒dna可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態。一是‘緊密型‘;二是‘鬆弛型‘。此外還應具有分子量，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般隻能攜帶10kb以下的dna片段。適用於構建原核生物基因文庫，dna庫和次級克隆。

    柯斯(s)質粒是一類帶有噬菌體dna粘性末端順序的質粒dna分子。是噬菌體-質粒混合物。此類載體分子容量大，可攜帶45kb的外源dna片段。也能象一般質粒一樣攜帶片段dna，直接轉化寄主菌。這類載體常被用來構建高等生物基因文庫。

    而噬菌體dna。常用的λ噬菌體的dna是雙鏈。長約49kb，約含個基因，其中%的基因對噬菌體的生長和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體dna兩端。中間是非必需區，進行改造後組建一係列具有不同特點的載體分子。λ載體係統最適用於構建真核生物基因文庫和dna庫。

    1噬菌體是一種獨特的載體係統，它隻能侵襲具有f基因的大腸杆菌，但不裂解寄主菌。1dna(rf)在寄主菌內是雙鏈環狀分子，象質粒一樣自主複製。製備方法同質粒。寄主菌可分泌含單鏈dna的1噬菌體，又能方便地製備單鏈dna。用於dna順序分析、定點突變和核酸雜交。

    接著是dna載體的連接。

    dna分子與載體分子連接是克隆過程中的重要環節之一，方法有:1粘性末端連接，dna片段兩端的互補堿基順序稱之為粘性末端，用同一種限製性內切消化dna可產生相同的粘性末端。在連接的作用下可恢複原樣，有些限製性內切雖然識別不同順序，卻能產生相同末端。平頭末端連接，用物理方法製備的dna往往是平頭末端，有些也可產生平頭末端。平頭dna片段可在某些dna連接作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高;同聚寡核酸末端連接。4人工接頭分子連接，在平頭dna片段末端加上一段人工合成的、具有某一限製性內切識別位點的寡核酸片段，經限製性內切作用後就會產生粘性末端。